Інтерферують регулювати клітинних процесів шляхом прив'язки до цільової мРНК. Таким чином визначення мРНК-мішеней є ключем до зрозуміти функції Мирна. Тут ми докладно метод для виявлення мішенню мРНК клітинних Мирна. Цей протокол є адаптована з Вані і ін. 35 зі зміною використання біотінілірованние на основі LNA Мирна імітує для випадають цільової мРНК. Використання на основі LNA олигонуклеотида імітує підвищує специфічність цільового об'єкта прив'язки через більшу стабільність модифікованих рибози кільця без токсичних еффектов36,, 3738. Ми використовували цей метод, щоб тягнути вниз мРНК ППА-1 як цільової стільникових мікроРНК miR-125b. Високий рівень експресії світ 125b виявлений в тканинах мозку, який регулює функції нейронов39,40. У спробі визначити цілі світ 125b в нейрональних клітин недавно ми повідомляли, що цей світ 125b негативно регулює ППА-1 вираз шляхом прив'язки до 3 'УТР ППА-1 мРНК41.

Розкривається miRNA: mRNA комплекс

Ми використовували ГЕС 293T клітини для вивчення взаємодії між мир 125b і ППА-1 мРНК, так як ці клітини широко використовується в стільникових, біохімічні та молекулярно-біологічних досліджень. Схематичне зображення протокол, який використовується для цільової мРНК зображений на малюнку 1. По-перше ГЕС 293T клітини (4 x 105- 5 x 105 за добре) були посіяні на ніч в пластині 6-ну тканинні культури і інкубують при 37 ° C з 5% CO2 для 18 - 24 години. Після цього 75 пікомоль 3'-біотінілірованние світ 125b міміки і 3'-біотінілірованние кинулися контролю були transfected в клітини, використовуючи метод трансфекції на основі ліпосом. Transfected клітин були інкубували при 37 ° C і 5% CO2 для додаткових 36 h і збирають. Після цього стільникового лизатов transfected клітин були підготовлені лизис методом заморожування відтавання. Свіжоприготовані стільникового лизатов інкубували з заблокованих стрептавідину покриттям магнітні намиста на лавці Топ nutating змішувач для 1 ч при кімнатній температурі. Після цього намистини були оброблені і промивають за допомогою свіжозавареним підготовлений крижаний випадає мити буфера на магнітний сепаратор. Нарешті намистини були високомобільні в 100 мкл нуклеінази вільної води для подальшого аналізу.

Виявлення мети мРНК в спадному miRNA: mRNA комплекс

Для виявлення цільового мРНК в світ 125b зі спадного суміші, ми зайняті ПЛР аналізу (рис. 1). Ми розробили прямого і зворотного грунтовки (FP і RP) в межах ORF посилити мРНК ППА-1 (рис. 2 Таблиця 5b). Ми також розроблені набори Праймери для виявлення p53 мРНК, відомий мішенню світ 125b42, як позитивний елемент управління і включити Праймери для того щоб посилити актину мРНК як негативний контроль неспецифічний. Крім того для подальшого підтвердження, специфіки ампліфікації, ми розробили Праймери для виявлення 3 'УТР регіонів ППА-1, p53 і актину. Ми виконували ПЛР, використовуючи методи, описані в протоколі (стаття 6).

Малюнок 3 показує ПЛР на основі посилення цільової мРНК у відносно кинулися елементів управління з очищеного бісеру. Рівень мРНК ППА-1 був помітно вище в зразках потягнув вниз з біотінілірованние світ 125b імітує в порівнянні з платних елементів управління. Як очікується, більш високі рівні mRNA позитивний контроль p53 мРНК і мінімальним посилення актину негативний контроль мРНК спостерігалося в цих зразках. Подібні рівні посилення були отримані за допомогою грунтовки, орієнтації 3 'УТР ППА-1 і p53 у порівнянні з негативного контролю актину (рис. 3B). ПЛР результати ORF регіонів (Малюнок 3А) і 3 'УТР регіонів (рис. 3B) ППА-1 мРНК і p53 мРНК показали деякі рівень мінливості. Декілька факторів, включаючи спорідненість, кількість сайтів зв'язування Мирна і відмінності в грунт послідовності залежних ампліфікації можуть сприяти різні рівні посилення на малюнку 3. Проте ці дані рішуче підтримують можливості і специфічність методу для перевірки мРНК-мішеней клітинних адаптивної.

Малюнок 1: Схематичне представлення протоколу для assay захоплення цільової допомогою біотінілірованние miRNA імітує. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: конструкція праймера для ампліфікації мРНК-мішеней ,. Схематичне уявлення грунти, який використовується для визначення цільової мРНК світ 125b. Один набір грунтовки (набір я) був розроблений в рамках регіону ORF стенограми і інший набір праймерів (набір II) був розроблений в регіоні UTR 3 'генів-мішеней. FP і RP представляють собою прямого і зворотного Праймери для кожного набору. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: світ 125b цільової ідентифікації ПЛР. Рівні mRNA (A) за допомогою набору грунт, який підсилює регіоні ORF таргетинг мРНК. Більш високі рівні вираження ППА-1 і p53 мРНК (позитивний контроль) спостерігалися в порівнянні з актину мРНК (негативний контроль). (B) посилення 3 'УТР регіону цілі мРНК, використовуючи праймер набір II. Ні посилення спостерігалася шаблон елементів управління (NTC). Всі реакції були виконані в triplicates, і дані були проаналізовані з використанням програмного забезпечення аналізу відповідних даних, засновану на методі 2-ΔCt. Планки похибок представляють Ефективне значення помилка середнього значення. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Шаблон (РНК) 50 нг / мкл 1.0 МКЛ Реакція буфер 5 x 4.0 МКЛ праймерів Oligo dT Майстер фондовій 2 МКЛ Зворотною транскриптази Майстер фондовій 1 МКЛ Нуклеази безкоштовна дистильована вода - 12 МКЛ Загальна реакція обсяг 20 МКЛ

Таблиця 1: синтез cDNA реакційної суміші.

105 ° C = 30 s 42 ° C = 60 хв 95 ° C = 5 хв 10 ° C = Hold

Таблиця 2: cDNA теплової Велоспорт умов синтезу.

cDNA продукт - 1.0 МКЛ iTaq універсальний SYBR мікс 2 x 5.0 МКЛ Цільовий (ORF / 3 'УТР) ф.з. 10 МКМ 0.5 МКЛ Цільовий (ORF / 3 'УТР) р.п. 10 МКМ 0.5 МКЛ Нуклеази безкоштовна дистильована вода - 3 МКЛ Загальна реакція обсяг 10 МКЛ

Таблиця 3: ПЛР реакційної суміші.

95 ° C = 10 хв 30 циклів: 95 ° C = 10 s 56 ° C = 30 s 72 ° C = 30 s розплаву аналізу кривої S 65 ° C = 31 Лінійна швидкість рамп = 0,5 ° C / s Придбання = інтервали 0.5 ° C

Таблиця 4: ПЛР термічних умов Велоспорт.

має світ 125b 25 МКМ UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-біотин Кинулися управління 25 МКМ GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-біотин (B) грунти Цільовий грунт (ORF) Фондова Послідовність (5 'до 3') ППА-1 (FP) 100 МКМ GAGGTGGATGGGTTCTCTGA ППА-1 (RP) 100 МКМ ACACCCCTTGCACGTACTTC p53 (FP) 100 МКМ TGTGACTTGCACGTACTCCC p53 (RP) 100 МКМ ACCATCGCTATCTGAGCAGC актину (FP) 100 МКМ GCTCGTCGTCGACAACGGCTC актину (RP) 100 МКМ CAAACATGATCTGGGTCATCTT (C) грунти цільовий грунт (3 'УТР) Фондова Послідовність (5' до 3 ') ППА-1 (FP) 100 МКМ ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT ППА-1 (RP) 100 МКМ CTACCCATCAGCAACTTAGCG p53 (FP) 100 МКМ GGCCCATATCTGTGAAATGC p53 (RP) 100 МКМ CTGCAGGAAGGCAGGTTTT

Таблиця 5: олігонуклеотиду імена і послідовності.